ในปี ค.ศ. 1479 โปรตุเกสและกัสติยา-อารากอนได้ยุติความขัดแย้งที่มีต่อกันด้วยการทำสนธิสัญญาอัลกากูวัส เพื่อฟื้นฟูราชอาณาจักรอิสปาเนียของชาวคริสต์ในคาบสมุทรไอบีเรียขึ้นมาใหม่ สนธิสัญญาได้ระบุให้มีการสมรสเพื่อรวมราชวงศ์ระหว่างเจ้าหญิงอิซาเบลกับอาฟงซู เจ้าชายรัชทายาทแห่งโปรตุเกส พระราชโอรสที่เหลืออยู่เพียงคนเดียวของพระเจ้าฌูเวาที่ 2 อิซาเบลออกเดินทางไปโปรตุเกสและเข้าพิธีสมรสซึ่งถูกจัดขึ้นในวันที่ 20 พฤศจิกายน ค.ศ. 1490 ที่กรุงตรือมูซ โดยอิซาเบลมีพระชนมายุ 20 พรรษา ส่วนเจ้าชายอาฟงซูมีพระชนมายุ 15 พรรษา แม้จะมีพระชนมายุต่างกันแต่สองหนุ่มสาวตกหลุมรักกันทันทีที่เห็นหน้ากันเป็นครั้งแรก การสมรสที่เริ่มต้นด้วยเหตุผลทางการเมืองจึงการเป็นสมรสที่มีความรักให้แก่กัน

ทว่าชีวิตสมรสที่มีความสุขของอิซาเบลและอาฟงซูจบลงอย่างรวดเร็วเมื่อในวันที่ 13 กรกฎาคม ค.ศ. 1491 เจ้าชายหนุ่มสิ้นพระชนม์ด้วยอุบัติเหตุตกจากหลังม้า เนื่องจากยังไม่มีพระโอรสธิดา อิซาเบลจึงเดินทางกลับสเปนไปอยู่ที่กรุงเซบียา

การสิ้นพระชนม์ของเจ้าชายอาฟงซูทำให้พระเจ้าฌูเวาที่ 2 ไม่เหลือทายาทตามกฎหมาย พระองค์ได้ประกาศให้มานูแวล ดยุคแห่งวิเซว ลูกพี่ลูกน้องและพระอนุชาของพระมเหสีเป็นทายาทในบัลลังก์